Generació d'un model cel·lular deficitari en la producció d'energia mitocondrial mitjançant mutagènesi dirigida sobre la subunitat c de la F0F1-ATP sintasa

Abstract

[cat] es mutacions en el DNA mitocondrial (mtDNA) provoquen un gran nombre de trastorns, que es manifesten amb una gran varietat de fenotips clínics. La principal característica que tenen en comú aquestes malalties és la disfunció del sistema de fosforilació oxidativa, i el conseqüent dèficit en la síntesi d’ATP. Avui en dia no existeixen tractaments eficaços per aquests desordres, i el desenvolupament de teràpies s’ha vist dificultat per la complexitat de la maquinària que regula la respiració mitocondrial i per la falta de bons models animals que permetin testar noves aproximacions terapèutiques. Concretament, la síndrome dual NARP/MILS es deu a mutacions en el gen codificat en el mtDNA que expressa la subunitat A6L de l’ATP sintasa. La mutació més freqüent introdueix una càrrega positiva en la subunitat que altera la translocació de protons a través de l’ATP sintasa i, per tant, la producció d’ATP. Donat que no disposem de la tecnologia per introduir àcids nucleics en els mitocondris, la nostra hipòtesi defensa que mitjançant la mutació de residus clau de la subunitat c, codificada pel DNA nuclear (nDNA) i també imprescindible pel flux de protons, podríem generar un model cel·lular deficient en la síntesi d’ATP mitocondrial que reprodueixi els fenotips de NARP/MILS. Amb aquesta finalitat, en aquest treball hem generat diferents formes mutants de la proteïna subunitat c de l’ATP sintasa i hem demostrat en un sistema cel·lular de mamífer que les subunitats c recombinants portadores de les mutacions E58Q i S21A s’expressen en els mitocondris, s’ensamblen en l’ATP sintasa i provoquen disfunció de la síntesi d’ATP. Aquests resultats reforcen la nostra hipòtesi i ens permeten procedir en la generació d’un model murí knock-in portador de la mutació E58Q en la subunitat c de l’ATP sintasa

[eng] Mutations in the mitochondrial DNA (mtDNA) cause a large number of disorders associated to a wide range of clinical phenotypes. Their common threat is the dysfunction of the oxidative phosphorylation system, and consequently a decrease in ATP synthesis. Currently there are not effective treatments for these diseases, and the complexity of the biochemical machinery that regulates mitochondrial respiration and the lack of good animal models to test novel therapeutic approaches have complicated the development of therapies. The dual NARP/MILS syndrome is specifically due to mutations in the mtDNA gene that codifies for the A6L subunit of the ATP synthase, and the most prevalent mutation inserts a positive charge into the protein that impairs proton translocation through ATP synthase and consequently, ATP production. Since there is no available technology to introduce nucleic acids in the mitochondria, we hypothesize that by mutating key residues of the subunit c, encoded by the nuclear DNA (nDNA) and also required for the proton transport, we will be able to generate a cellular model deficient in mitochondrial ATP synthesis that reproduces the NARP/MILS phenotypes. For this reason, in this work we have generated different mutant forms of ATP synthase subunit c and we have demonstrated that recombinant subunit c proteins harboring the mutations E58Q and S21A are expressed in the mitochondria, assemble into the ATP synthase and impair ATP production. These results reinforce our working hypothesis and encourage us to proceed with the generation of the knock-in mouse harboring the mutation E58Q in the subunit c of the ATP synthase.