Identificación de la proteína responsable de producir una banda inespecífica de 75kDa en los inmunoblots para la proteína Sirtuina 1 en muestras cerebrales de rata

Abstract

[spa] El incremento de la esperanza de vida en la población estos últimos años gracias al desarrollo de la medicina y la tecnología ha derivado en un aumento de enfermedades relacionadas con la edad, en concreto, las que producen un deterioro cognitivo. Se ha observado que en el transcurso del envejecimiento se observan acentuados cambios morfológicos y funcionales en áreas cerebrales implicadas en procesos de memoria y aprendizaje. Al disponer de una mayor proporción de población longeva, se ha generado la necesidad de entender las modificaciones cerebrales que suceden durante este envejecimiento para hallar métodos encaminados a retrasar, prevenir y atenuar las consecuencias. Todo y que no se han identificado los mecanismos implicados en este proceso de envejecimiento, se han asociado a este el aumento de estrés oxidativo y el incremento de la inflamación como causas fundamentales. Multitud de estudios han identificado que cambios en la proteína SIRT1, procedente de la familia de las sirtuínas, puede mediar mucho de estos efectos deletéreos del envejecimiento y a su vez ser responsable de los efectos neuroprotectores de muchas terapias que retrasan este envejecimiento cerebral. Los efectos protectores de SIRT1 (110 kDa) están mediados por su actividad deacetilasa hacía histonas, modificando su unión al ADN y regulando la expresión de genes (efectos epigenéticos) y por otro lado por modificación directa de la actividad de otras proteínas (también por deacetilación), por ejemplo NF-kB, entre otras. Se han descrito para condrocitos que estos efectos protectores se deben a un fragmento de 75 kDa procedente de la fragmentación proteolítica de SIRT1 (110 kDa), el cual protege a las células frente a la situaciones de inducción a apoptosis derivado de una respuesta a la inflamación en estas condiciones. El objetivo de este trabajo fue comprobar si una banda inespecífica de alrededor de 75 kDa observada en los Western blot en muestras cerebrales de rata y que incrementa durante el envejecimiento correspondía a una forma truncada de la forma nativa de SIRT1 (110 kDa) y a la misma banda identificada en condrocitos de 75 kDa. Para ello se analizaron las bandas de 75 kDa y 110kDa, tras una electroforesis SDS-PAGE, mediante la técnica MALDI-TOF (análisis de los fragmentos obtenidos tras la tripsinización) y se procedió a comparar los resultados obtenidos con una base de datos disponible. Se comprobó que tras los pertinentes análisis de la banda inespecífica de 75 kDa, no se podía afirmar que dicho fragmento correspondía a una forma truncada de SIRT1 (110 kDa), ya que no fue posible la identificación de la proteína responsable de producir dicha banda inespecífica. Ante tal situación, se discutieron los problemas metodológicos que provocaron estos resultados y se expusieron posibles alternativas y mejoras en los procesos llevados a cabo para abordar este análisis con éxito.

[eng] The increase of life expectancy in population this recent years due to the development of medicine and technology, has led to an increase in age-related diseases, specifically, those that produce a cognitive decline, because it’s observed accentuated morphological and functional changes in brain areas involved in memory and learning processes. By having a greater proportion of the long-lived population, there has been the need to understand the brain changes that occur during this aging to find methods aimed to delaying, preventing and mitigating the negative consequences. The mechanisms involved in aging are unknown, but they have been associated with the increase in oxidative stress and the increase in inflammation as fundamental causes. Many studies have identified that changes in the protein SIRT1 deacetylase can mediate much of these deleterious effects of aging and in turn be responsible for the neuroprotective effects of many therapies that delay brain aging. The protective effects of SIRT1 (110 kDa) are mediated by deacetylase activity towards histones, modifying binding to DNA and regulating the expression of genes (epigenetic effects) and on the other hand by direct modification of the activity of other proteins (also by deacetylation ), for example NF-kB, among others. They have been described for chondrocytes that these protective effects are due to a fragment of 75 kDa from the proteolytic fragmentation of SIRT1 (110 kDa), which protects the cells against the situations of induction to apoptosis derived from a response to inflammation in these conditions. The objective of this work was to verify if a nonspecific band of around 75 kDa observed in Western blots that increases during aging corresponded to a truncated form of the native form of SIRT1 (110 kDa) and to the same band identified in 75 kDa chondrocytes. To this end, the 75 kDa and 110 kDa bands were analyzed, after an SDS-PAGE electrophoresis, using the MALDI-TOF technique (analysis of fragments obtained after trypsinization) and the results obtained were compared with an available database. It was checked that after the relevant analysis of the not specific band of 75 kDa, it couldn’t affirmed that fragment corresponded to a truncated form of SIRT1 (110 kDa) due to was not possible to identify the protein responsible to produce that not specific band. In view of this situation, the methodological problems that caused these results were discussed and possible alternatives and improvements in the processes carried out to address this analysis with success.