Efecto del bloqueo del reciclaje del peptidoglicano y la expresión de B-lactamasas sobre la virulencia de Enterobacter cloacae

Abstract

[cat] Introducción/Objetivos: Enterobacter cloacae (EC) es un bacilo Gram negativo (GN) perteneciente a los ESKAPE pathogens, grupo que engloba a las especies patógenas nosocomiales más relevantes por su nivel de resistencia a los antibióticos. Ello es una clara muestra de la amenaza que supone EC para la salud pública, sobre todo en la actual situación de creciente reducción de nuestro arsenal antibiótico útil. Por estos motivos es urgente hallar puntos débiles en la biología de EC que puedan ser explotados en el futuro como dianas terapéuticas. En el pasado se demostró que la suma de: i) bloqueo del reciclaje del peptidoglicano (PGN) y ii) hiperproducción de la b-lactamasa intrínseca AmpC, determinan una drástica pérdida de virulencia en otro patógeno ESKAPE como es Pseudomonas aeruginosa (PA). En el presente estudio se quiso comprobar si estos fenómenos se reproducen en EC. Metodología: se construyó un mutante knockout (KO) en ampG (esencial para el reciclaje del PGN) en la cepa de EC subsp. cloacae (ECSC) ATCC 13047, siguiendo protocolos publicados. Se transformaron la cepa salvaje y ΔampG con un plásmido multicopia conteniendo ampC de PA (pUCPACpa). También se utilizó un mutante de EC hiperproductor de AmpC intrínseca (cuya base era la inactivación mutacional de ampD, represor indirecto de ampC y participante en el reciclaje del PGN). Para determinar la virulencia se inyectaron distintas dosis de estas cepas en larvas de Galleria mellonella, y se incubaron a 30 °C monitorizando la mortalidad a 24, 48, 72 y 96 h. Con los datos recopilados se realizaron gráficos tipo Kaplan-Meier y las diferencias entre cepas se valoraron por log Rank test, tomando p<0,05 como significativo. Resultados: la inactivación de ampG no tuvo impacto sobre la virulencia de EC, mientras que la hiperproducción de AmpC (tanto intrínseca como clonada de PA) sí tuvo un efecto significativo en la supervivencia de las larvas de G. mellonella. Por ejemplo, después de 96 h de infección con 1,25x107 unidades formadoras de colonias (UFC), la cepa salvaje y ΔampG causaron aproximadamente un 75% de mortalidad, mientras que la mortalidad de las 2 cepas portadoras de pUCPACpa, estuvo por debajo del 40%. La hiperproducción de AmpC intrínseca de EC mediada por la inactivación de ampD también supuso una disminución significativa en la mortalidad (1,25x107 UFC, 96 h: »50%). Conclusiones: la hiperproducción de AmpC conlleva una notable atenuación de la virulencia en EC. Una potencial actividad residual de AmpC (más fuerte en AmpC de PA) sobre el PGN de EC, causante de su degradación y consiguiente pérdida de viabilidad y virulencia, podría explicar los resultados obtenidos. El bloqueo del reciclaje del PGN per se, no tuvo impacto sobre la virulencia de EC, tal como ocurre en PA. Este estudio muestra diferencias/similitudes en la interacción resistencia-PGN-virulencia en PA vs EC, potencialmente útiles para el diseño de estrategias terapéuticas destinadas a atenuar la virulencia de EC.