Control intern d’amplificació combinada amb PCR en temps real per a Xylella fastidiosa a ametller (Prunus dulcis)

Abstract

[cat] El Laboratori Oficial de Sanitat Vegetal de les Illes Balears (LOSVIB) ha iniciat la preparació per l’acreditació per l’Entitat Nacional d’Acreditació (ENAC) i el compliment de la norma EN ISO/IEC 17025 per a l’assaig de detecció de Xylella fastidiosa en mostres vegetals per PCR en temps real. Per tal de que es pugui acreditar, es necessari introduir un control intern d’amplificació combinada (IAC) que asseguri la no inhibició de la PCR en cada una d’elles. No apareixen IACs en mostres vegetals ni als protocols de PCR que es reflecteixen a EPPO 7/24 ni al Reglament d’Execució (UE) 2020/1201, per la qual cosa, s’ha d’escollir un control vàlid i apte per a l’assaig. Per aquesta raó, a n’aquest treball s’ha testat amb programes bioinformàtiques (BLAST) i assajos de PCR en temps real la viabilitat de seqüències d’ADN, per tal utilitzar-les com a IAC amb la PCR en temps real per a Xylella fastidiosa descrita per Harper et al. (2010; erratum 2013) per a ametller (Prunus dulcis), espècie que va mostrar problemes d’amplificació al laboratori amb anterioritat. Mitjançant els assajos amb el programa bioinformàtic BLAST, molts gens pareixen bons candidats per a IAC, com per exemple 18S, Actina, ALDH, LOS1, UBQ9 i KUP9. Encara que algunes seqüències de gens diana semblen funcionar amb altres espècies vegetals, no funcionen bé amb ametller, per la qual cosa, s’han de descartar, com ens ha passat amb els gens COX, on hi ha hagut problemes tant amb els assajos amb BLAST, com en els assajos en condicions de laboratori. De les seqüències de gens que s’han testat al laboratori, la que millor ha funcionat és el 18S, que també s’utilitza com a IAC a PCR d’insectes.