Caracterització funcional de la proteïna PATJ en la dinàmica del citoesquelet d’actina en cèl·lules endotelials i la seva implicació en el pronòstic funcional de l’ictus isquèmic

Abstract

[spa] L'ictus és una malaltia cardiovascular que suposa una de les principals causes de mort i discapacitat a nivell mundial, amb una incidència creixent als països en desenvolupament. S’ha trobat una correlació positiva entre la infra-expressió de la proteïna PATJ, integrant del complex de polaritat Crumbs, i pronòstic funcional favorable als tres mesos després de l’ictus. L’angiogènesi, la formació de nous vasos sanguinis a partir de preexistents, és un procés necessari per regenerar la lesió isquèmica, ja que permet re-abastir el teixit afectat. Dades prèvies del grup receptor han demostrat que la infra-expressió de PATJ afavoreix la transició de cèl·lula endotelial a mesenquimal, afavorint un fenotip propi de les cèl·lules de la punta en un procés angiogènic. L’objectiu principal del treball de fi màster és demostrar que el fenotip mesenquimal induït per la depleció de PATJ es deu a una remodelació del citoesquelet d’actina. Per desenvolupar aquest objectiu s’han estudiat cèl·lules endotelials HCMEC/D3 deplecionades de PATJ mitjançant infecció amb vectors lentivirals portadors del ARN d’interferència contra el gen PATJ. La dinàmica del citoesquelet d’actina s’ha determinat avaluant els ratis d’actina filamentosa (actina F) i actina globular (actina G) amb un protocol específic. Amb la finalitat de determinar una potencial associació entre el citoesquelet d’actina i la via de senyalització Hippo, seguidament s’ha mesurat la localització cel·lular dels seus coactivadors de la transcripció YAP/TAZ, separant per subfraccionament la fracció citoplasmàtica i la fracció nuclear i quantificant YAP/TAZ per WB. Els nostres resultats demostren que la infra-expressió de PATJ disminueix el rati actina F/actina G, aportant a les cèl·lules deplecionades de PATJ major dinamisme. Alhora, hem demostrat que aquests canvis en la dinàmica del citoesquelet d’actina es deuen a una re-localització dels co-activadors YAP/TAZ, que efecte de la depleció de PATJ s’acumulen al nucli. Els resultats obtinguts reforcen la interrelació entre la infra-expressió de PATJ després de l’ictus i l’adopció del fenotip de cèl·lula de la punta, necessària per l’activació de l’angiogènesi i la conseqüent re-vascularització de la lesió isquèmica.

[eng] Stroke is one of the leading causes of death and disability worldwide, with a growing incidence in developing countries. In stroke outcome, a positive correlation was found between the Crumbs polarity protein PATJ downregulation and favourable functional prognosis. Angiogenesis, the formation of new blood vessels from pre-existing ones, is a necessary process to regenerate the ischemic injury, as it allows to replenish the affected tissue. Previous data from the receptor group have shown that PATJ knockdown favours the endothelial to mesenchymal transition, favouring a phenotype typical of tip cells in an angiogenic process. The main aim of the final master's thesis is to show that the mesenchymal phenotype induced by PATJ depletion is due to a remodelling of the actin cytoskeleton. To develop this goal, PATJ-depleted HCMEC / D3 endothelial cells were generated by lentiviral infection with vectors carrying short hairpin RNA against PATJ gene. The dynamics of the actin cytoskeleton was determined by evaluating the ratio between filamentous actin (actin F) and globular actin (actin G) using an specific protocol. Furthermore, to determine a potential association between the actin cytoskeleton and the Hippo signalling pathway, we measured the cellular location of its YAP / TAZ transcription co-activators, separating the cytoplasmic and nuclear fractions by subcellular fractionation and quantifying YAP/TAZ by WB. Our results show that PATJ knockdown (KD) decreases the F/ G actin ratio, apporting greater dynamism to PATJ KD cells. At the same time, we have shown that these changes in actin cytoskeleton dynamics are due to a re-localization of YAP/TAZ co-activators to the nucleus. The results obtained reinforce the interrelationship between the under-expression of PATJ after stroke and the adoption of the tip cell phenotype, necessary for the activation of angiogenesis and the consequent re-vascularization of the ischemic lesion.