Diseño, construcción y aplicación de mini transposones derivados de miniUIB

Abstract

[spa] Los mini transposones son estructuras genéticas artificiales derivadas de transposones, los cuales han sido reorganizados con el fin de disminuir su tamaño. Hasta la fecha, se han descrito una gran variedad de estructuras de mini transposones. El más conocido y utilizado es mini-Tn5, pero éste presenta algunas limitaciones, como es la inestabilidad de la construcción si esta carece de inserto. MiniUIB ha presentado una gran estabilidad y eficacia para generar una mutagénesis aleatoria estable con o sin inserto, tanto en bacterias Grampositivas como en Gramnegativas. El objetivo del estudio es expandir las posibilidades de mutagénesis con miniUIB a bacterias resistentes a Kanamicina, pero sensibles a otros antibióticos. Esto realiza con la inserción de un caset de resistencia a antibiótico en la estructura miniUIB, concretamente Cloranfenicol, Gentamicina y Tetraciclina, además de generar de nuevo un mini transposón miniUIB con un inserto que proporcione resistencia a Kanamicina diferente al que ya se ha generado previamente. La inserción de cada caset de resistencia puede producirse con dos orientaciones. Tras la generación de dichas construcciones en el plásmido suicida pJOC100, se introducen por transformación en la célula huésped. Dicho vector presenta el origen de replicación R6K, por lo que sólo va a poder replicar en una célula que presenta integrado en su genoma la maquinaria de replicación del fago λ (pirógeno de λ), como es E.coli S17.1 λ pir. Mediante conjugación, los plásmidos pJOC100 antibióticoresistentes, son transferidos a la cepa receptora, Pseudomonas stutzeri AN10s. La actividad de transposición de miniUIB se incrementa tras el proceso conjugativo integrándose, la estructura, al azar en el genoma de la célula receptora. Una vez realizado este proceso, se calculan las frecuencias de transposición de los ocho derivados antibiótico-resistentes obtenidos demostrándose que, aunque una orientación del caset no promueva una mayor frecuencia de transposición que la contraria, las construcciones presentan unas tasas similares a mini-Tn5, siendo una opción viable con bacterias que han demostrado ser resistentes a Kanamicina.

[cat] Els mini-transposons són estructures genètiques artificials derivades dels transposons, els quals han estat reorganitzats amb l'objectiu de reduir-ne la mida. Fins a la data, s'han descrit una gran varietat d'estructures de mini-transposons. El més conegut i utilitzat és el mini-Tn5, però aquest presenta algunes limitacions, com ara la inestabilitat de la construcció si li falta un insert. El miniUIB ha demostrat una gran estabilitat i eficàcia per generar una mutagènesi aleatòria estable, amb o sense un insert, tant en bacteris Grampositius com en Gramnegatius. L'objectiu de l'estudi és ampliar les possibilitats de mutagènesi amb el MiniUIB a bacteris resistents a la Kanamicina, però sensibles a altres antibiòtics. Això es realitza amb la inserció d'un cassete de resistència a antibiòtic en l'estructura del MiniUIB, concretament Cloranfenicol, Gentamicina i Tetraciclina, a més de generar de nou un mini-transposon miniUIB amb un insert que proporcioni resistència a la Kanamicina diferent de la ja generada prèviament. La inserció de cada cassete de resistència pot produir-se amb dues orientacions. Després de generar aquestes construccions en el plasmidi suïcida pJOC100, s'introdueixen per transformació a la cèl·lula hoste. Aquest vector presenta l'origen de replicació R6K, de manera que només podrà replicar en una cèl·lula que tingui integrada en el seu genoma la maquinària de replicació del fag λ (pirògen de λ), com ara E. coli S17.1 λ pir. Mitjançant conjugació, els plasmidis pJOC100 resistents a antibiòtics es transfereixen a la soca receptora, Pseudomonas stutzeri AN10s. L'activitat de transposició del MiniUIB s'incrementa després del procés conjugatiu, integrant la seva estructura aleatòriament en el genoma de la cèl·lula receptora. Un cop realitzat aquest procés, es calculen les freqüències de transposició dels vuit derivats resistents a antibiòtics obtinguts, demostrant que, tot i que una orientació del cassete no promou una major freqüència de transposició que l'altre, les construccions presenten unes taxes similars al Mini-Tn5, sent una opció viable per a bacteris que han demostrat resistència a la Kanamicina.

[eng] Mini transposons are artificial genetic structures derived from transposons, which have been reorganized to reduce their size. To date, a wide variety of mini transposon structures have been described. The most well-known and commonly used one is miniTn5, but it has some limitations, such as construction instability when lacking an insert. MiniUIB has demonstrated significant stability and effectiveness in generating stable random mutagenesis, with or without an insert, in both Gram-positive and Gram-negative bacteria. The objective of the study is to expand the possibilities of mutagenesis with miniUIB to bacteria resistant to Kanamycin but sensitive to other antibiotics. This is achieved by inserting an antibiotic resistance cassette into the miniUIB structure, specifically Chloramphenicol, Gentamicin, and Tetracycline, in addition to generating a new miniUIB transposon with an insert that provides resistance to Kanamycin different from what has been previously generated. The insertion of each resistance cassette can occur in two orientations. After generating these constructs into the suicide plasmid pJOC100, they are introduced into the host cell through transformation. This vector has the R6K replication origin, therefore it can only replicate in a cell that has integrated the λ phage replication machinery into its genome (λ pir). An example of such a cell is E. coli S17.1 λ pir. Through conjugation, the antibiotic-resistant pJOC100 plasmids are transferred to the recipient strain, Pseudomonas stutzeri AN10s. The transposition activity of miniUIB increases after the conjugative process, randomly integrating the structure into the genome of the recipient cell. After this process is completed, the transposition frequencies of the eight antibiotic-resistant derivatives are calculated, demonstrating that while one orientation of the cassette does not promote a higher transposition frequency than the other, the constructs exhibit similar rates to mini-Tn5, making it a viable option for bacteria that have shown resistance to Kanamycin.