Development of an in vitro fibroblast hypoxia protocol

Abstract

[cat] L’envelliment és un procés gradual e innegable que pateix tot organisme al llarg de la seva vida. El declivi de les nostres funcions vitals i del correcte funcionament de les cèl·lules també és una conseqüència d’aquest procés natural. Certs estudis han presentat que la teràpia cel·lular amb hipòxia intermitent pot ser clau en l’alleujament del dany cel·lular que aquest causa. En el present estudi es planteja el tractament de fibroblasts amb certs químics (CoCl2, DFO i Na2SO3) i diferents temps per observar quan s’observava una major expressió de HIF-1α, proteïna encarregada de la resposta cel·lular i sistèmica a la hipòxia. El tractament cel·lular amb CoCl2 a les 4 hores fou on s’observà una major expressió de HIF-1α mitjançant un anàlisi per Western Blot. Una vegada aconseguit el protocol d’hipòxia, es va produir un silenciament cel·lular del receptor ADORA2B mitjançant un siRNA amb Lipofectamina per comprovar si els beneficis de la hipòxia s’obtenien a través d’ell. També es va experimentar si l’aplicació d’un medi condicionat (prèviament tractat amb CoCl2) afectava als fibroblasts. S’analitzà també l’expressió de certs gens que podien estar lligats al procés d’hipòxia mitjançant RT-qPCR. Els resultats indicaren una disminució en l’expressió d’A2B, VEGF-A i LDH-A en les cèl·lules exposades al medi condicionat tal vegada per la saturació d’adenosina extracel·lular que presentava el medi. Es creu també que la resposta de certs gens com mTOR o PINK-1 no actuen a través d’A2B. Finalment, la disminució de p21 ens indica que la teràpia amb hipòxia intermitent pot ser clau per el tractament dels danys causats per l’envelliment.

[eng] Aging is a gradual and undeniable process that every organism undergoes throughout its life. The decline in our vital functions and the correct functioning of cells is also a consequence of this natural process. Certain studies have shown that cell therapy with intermittent hypoxia can be key in alleviating the cell damage it causes. In the present study, the treatment of fibroblasts with certain chemicals (CoCl2, DFO and Na2SO3) and different times was conducted to observe the levels of HIF-1α, a protein responsible for the cellular and systemic response to hypoxia. The cell treatment with CoCl2 at 4 hours showed a greater expression of HIF-1α through a Western Blot analysis. Once the hypoxia protocol was achieved, cellular silencing of the ADORA2B receptor was produced using a siRNA with Lipofectamine to check if this receptor was responsible for the beneficial effects of hypoxia. It was also tested whether the application of a conditioned medium (previously treated with CoCl2) affected the fibroblasts. The expression of certain genes that could be linked to the hypoxia process was also analysed using RT-qPCR. The results indicated a decrease in A2B, VEGF-A and LDH-A expression in the cells exposed to the conditioned medium, perhaps due to the saturation of extracellular adenosine present in the medium. It is also believed that the response of certain gens such as mTOR or PINK-1 do not act through A2B. Finally, the decrease in p21 indicates that therapy with intermittent hypoxia may be key to the treatment of damage caused by aging.