Functional response of marine microbial communities to diesel pollution

Abstract

[eng] The changes caused by diesel oil pollution on metabolically active microorganisms from an oligotrophic coastal location have been investigated in this PhD Thesis. The analysis has been performed in laboratory microcosm experiments (44 l) to simulate typical hydrocarbon pollution events in a coastal area exploited for seasonal touristic activities. The experiment consisted in the addition of low amounts of diesel oil without nutrients to seawater collected at different times (winter and summer). Bacterial diversity was analysed by terminal-restriction fragment length polymorfism (T-RFLP) profiling of 16S rRNA after reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) in control and diesel-polluted microcosms, as well as by generation of clone libraries. Phytoplankton diversity (eukaryotic and prokaryotic) was assessed by cloning and sequencing RT-PCR products from mRNAs of genes involved in photosynthesis: psbA, coding for protein D1 of photosystem II; rbcL, coding for ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/oxygenase (RubisCO) large subunit; cpcBA and cpeBA, involved in the synthesis of the phycobiliproteins phycocyanin and phycoerythrin, respectively. In comparison with controls, diesel addition caused a 2-fold increase in prokaryotic numbers (both, in winter and summer), and a decrease in the number of picocyanobacteria (2.5-fold in winter and 5-fold in summer). Moreover, diesel addition caused a reduction in the expression of photosynthesis genes, particularly rbcLI forms A/B and cpcBA, in comparison with corresponding controls. The composition of bacterioplankton, eukaryotic phytoplankton, and picocyanobacteria changed rapidly (within 17-27 h) in response to treatment. There were significant differences in the composition of microbial communities in diesel-treated microcosms in comparison with the corresponding controls. For all three groups, the resulting communities were different in polluted microcosms prepared with water collected at different times, winter or summer. After diesel treatment, there was a reduction in the number of sequence types related to bacterial marine groups SAR11 and SAR86; clades I and II of Synechococcus sp.; and eukaryotic phytoplankton belonging to Prasinophytes (such as Micromonas or Ostreococcus), Bolidophytes and Cryptophytes. In contrast, the abundance of marine bacteria from the Roseobacter clade and the OMG group; clades V, VI and IX of Synechococcus sp., and eukaryotic algae from the Prymnesiophytes, Chlorarachniophytes and Pelagophytes increased in libraries from diesel-treated microcosms. The results of this PhD Thesis suggest that diesel pollution alone caused profound effects on the bacterioplankton of oligotrophic seawater, and was helpful to understand many of the differences in bacterial diversity reported previously in pristine and polluted sites in this coastal area. Diesel treatment also caused a rapid effect on active phytoplankton of oligotrophic coastal seawater and particularly affected members of the picophytoplankton, which are considered the main primary producers in oligotrophic marine environments.

[spa] En esta Tesis Doctoral se analizó el efecto de la contaminación por diesel en comunidades microbianas marinas metabólicamente activas de una zona costera oligotrófica. El estudio fue llevado a cabo utilizando microcosmos (44 l) que intentaban simular eventos probables de contaminación por hidrocarburos en una zona costera de explotación turística. El experimento consistió en la adición de diesel a bajas concentraciones, sin añadir nutrientes, a agua de una zona prístina colectada en dos tiempos diferentes (invierno y verano) para comparar posibles diferencias estacionales. La diversidad bacteriana se analizó en microcosmos control (sin tratamiento) y tratados con diesel mediante polimorfismo de longitud de restricción de fragmentos terminales (T-RFLP) de 16S ARN ribosómico tras transcripción inversa seguida de amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), así como mediante la construcción de genotecas. La diversidad del fitoplancton (procariota y eucariota) se analizó mediante clonación y secuenciación de productos de RT-PCR para ARN mensajero de genes involucrados en fotosíntesis: psbA, que codifica para la subunidad D1 del centro de reacción del fotosistema II; rbcLI, que codifica para la subunidad mayor del enzima ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa (RubisCO); cpcBA y cpeBA involucrados en la síntesis de las ficobiliproteínas ficocianina y ficoeritrina, respectivamente. El número de procariotas en ambos experimentos (invierno y verano) se duplicó tras la adición de diesel, en comparación con los valores de microcosmos control. Sin embargo, se observó una disminución del número de picocianobacterias (un factor de 2,5 veces en invierno y 5 en verano). Además, se observó una reducción en la expresión de genes involucrados en fotosíntesis, en especial las formas A/B de rbcLI y cpcBA en comparación con los correspondientes controles. La composición microbiana (bacterioplancton y fitoplancton) cambió muy rápidamente frente al tratamiento (dentro de las 17-27h). En todos los casos, las comunidades resultantes fueron diferentes al control y diferentes entre ellas al compararlas temporalmente (invierno/verano). Luego del agregado de diesel, se observó una reducción en el número de secuencias relacionadas con los grupos bacterianos marinos SAR11 y SAR86, los clados I y II de Synechococcus y los grupos de fitoplancton eucariota de las Prasinofitas (como Micromonas y Ostreococcus), Bolidofitas y Criptofitas. En cambio, había mayor abundancia de secuencias de los grupos bacterianos Roseobacter y OMG, clados V, VI and IX de Synechococcus, y representantes de los grupos de algas Primnesiofitas, Cloraracniofitas y Pelagofitas. Los resultados de esta Tesis Doctoral sugieren que la contaminación por diesel ocasiona cambios importantes en el bacterioplancton de aguas marinas oligotróficas, lo que ha permitido entender en parte las diferencias encontradas en diversidad bacteriana en áreas prístinas y contaminadas de la costa. Además, también se observó un efecto importante del diesel sobre la comunidad fotosintética activa de aguas costeras prístinas, principalmente a los componentes de menor tamaño (picofitoplancton), que son considerados los principales productores primarios en ambientes oligotróficos.