Effect of copper binding and post-translational modifications on the conformation of alpha-synuclein and on its ability to bind synaptic-like vesicles

Abstract

[cat] L’alfa-sinucleïna humana (αS) és una proteïna intrínsecament desordenada, expressada en grans quantitats a les neurones dopaminèrgiques. Els agregats amiloides d’αS són els components majoritaris dels cossos de Lewy, els quals són considerats un marcador distintiu de la malaltia de Parkinson (MP). Encara que la funció biològica principal de l’αS segueix sense ser clara, està plenament acceptat que les seves funcions (descrites fins ara) estan condicionades a la seva interacció amb membranes lipídiques. L’associació de l’αS amb membranes fosfolipídiques ocorre de forma simultània al seu plegament, des del seu estat monomèric desplegat desordenat cap a diferents conformacions α-helicoidals, un procés que es considera funcionalment rellevant. Malgrat això, l’associació de l’αS amb membranes lipídiques podria tenir també implicacions patològiques, augmentant la seva tendència a l’agregació. És ben sabut que la unió d’ions de coure a l’αS promou la seva agregació. Aquest descobriment va suggerir la implicació dels ions de coure en el desenvolupament de la MP. Emperò, l’efecte d’aquests ions sobre l’afinitat de l’αS per les membranes biològiques o sobre la conformació de l’αS unida a membranes encara no s’ha estudiat. Els agregats amiloides d’αS trobats als cossos de Lewy solen contenir modificacions post-traduccionals (MPTs). Entre elles destaca l’oxidació de les Met, la nitració de les Tyr i la glicosilació no enzimàtica (glicació) de les Lys. L’αS conté quatre Met i quatre Tyr susceptibles de ser oxidades i nitrades, respectivament, quan aquestes són sotmeses a condicions oxidants semblants a les observades als cervells de pacients amb MP. La glicació és un procés aleatori que ocorre sobre les cadenes laterals de les Lys com a resultat de la seva reacció amb especies reactives de carboni, produïdes com a productes secundaris de la glicòlisi intraneuronal. Molts són els estudis que han intentat trobar el mecanisme molecular que relaciona aquestes MPTs amb l’agregació de l’αS i amb el desenvolupament de la MP. Malgrat això, encara no es coneix com aquestes afecten a la funció biològica de l’αS, la qual està estretament lligada a la seva interacció amb membranes lipídiques. Aquest coneixement esdevé clau per entendre com aquestes MPTs poden contribuir al desenvolupament de la MP. En aquest treball de tesis, s’ha emprat un gran nombre de tècniques biofísiques per intentar entendre com la unió de coure i les MPTs (oxidació, nitració i glicació) afecten a la conformació de l’αS unida a membranes i a la seva afinitat cap a les membranes lipídiques. Per això, inicialment es va sintetitzar una αS homogèniament oxidada (αS-MetO), nitrada (αS-NO2) i glicada (αS-CEL). El treball de recerca desenvolupat en aquesta tesis demostra que la unió de Cu2+ o Cu+ no té cap efecte sobre la conformació α-helicoidal de l’αS unida a micel·les, ni en la seva capacitat per unir-se a elles. Alhora, s’ha demostrat que les tres MPTs estudiades tampoc canvien la conformació α-helicoidal de l’αS unida a membranes, encara que totes elles disminueixen l’afinitat de l’αS cap a membranes que simulen vesícules sinàptiques i minven la capacitat de l’αS per afavorir l’agrupació i la fusió de vesícules sinàptiques.

[spa] La alfa-sinucleína humana (αS) es una proteína intrínsecamente desordenada, altamente expresada en las neuronas dopaminérgicas. Los agregados amiloides de αS son componentes mayoritarios de los cuerpos de Lewy, los cuales son considerados una marca distintiva en la enfermedad de Parkinson (EP). Aunque la función biológica concreta de la αS está siendo todavía estudiada, se ha aceptado que sus funciones vienen siempre condicionadas por su interacción con membranas lipídicas. La unión de la αS a membranas fosfolipídicas ocurre de forma simultánea a su plegamiento, desde su estado monomérico desordenado hacia diferentes conformaciones α-helicoidales, las cuales se consideran funcionalmente relevantes. No obstante, esta unión podría tener también implicaciones patológicas, ya que en determinadas situaciones podría aumentar la tendencia de la αS a agregar. La unión de iones de cobre a la αS promueve su agregación. Este hallazgo sugirió la implicación de dichos iones en el desarrollo de la EP. Sin embargo, el efecto de estos iones sobre la afinidad de la αS por las membranas biológicas, o sobre la conformación de la αS unida a membranas, todavía no ha sido estudiado. Los agregados amiloides de αS encontrados en los cuerpos de Lewy suelen contener también modificaciones postraduccionales (MPTs). Entre ellas destacan la oxidación de Met, la nitración de Tyr y la glicosilación no enzimática (glicación) de las Lys. La αS contiene cuatro Met y cuatro Tyr susceptibles de ser oxidadas y nitradas, respectivamente, cuando se someten a condiciones oxidativas similares a las encontradas en los cerebros de pacientes con EP. La glicación es un proceso aleatorio que ocurre como resultado de la reacción de las cadenas laterales de las Lys con especies carbonílicas producidas como producto de la glicólisis intraneuronal. Muchos estudios han tratado de elucidar el mecanismo molecular que relaciona estas MPTs con la agregación de la αS y el desarrollo de la EP. Sin embargo, todavía se desconoce como éstas afectan a la función biológica de la αS, que está estrechamente relacionada con su interacción con membranas lipídicas. Su comprensión es clave para entender como éstas MPTs pueden contribuir al desarrollo de la EP. En este trabajo de tesis, se ha utilizado un amplio número de técnicas biofísicas para entender como la unión de cobre y las diferentes MPTs (oxidación, nitración y glicación) afectan a la conformación de la αS unida a membranas y a su afinidad por las membranas lipídicas. Para ello, se sintetizó previamente αS homogéneamente oxidada (αS-MetO), nitrada (αS-NO2) y glicada (αS-CEL). El trabajo presentado aquí demuestra que la unión de Cu2+ o Cu+ no tiene ningún efecto en la conformación α-helicoidal de la αS unida a micelas, ni en su capacidad de asociarse a las mismas. De forma similar, las tres MPTs estudiadas tampoco alteraron, de manera significante, la conformación α-helicoidal de la αS unida a membranas. Sin embargo, todas ellas disminuyeron la afinidad de la αS por membranas miméticas de vesículas sinápticas y disminuyeron su capacidad para promover la agrupación y la fusión de vesículas sinápticas.

[eng] Human alpha-synuclein (αS) is an intrinsically disordered protein highly expressed in dopaminergic neurons. Its amyloid aggregates are the main component of Lewy bodies, which are considered a hallmark of Parkinson’s disease (PD). Although its physiological function is still under debate, it is accepted that its biological roles are always mediated by its interaction with lipid membranes. The binding of αS with phospholipid membranes occurs concomitant to its folding from its monomeric unfolded state towards different α-helical conformations, a transition that is considered functionally relevant. Nevertheless, this binding might also have pathological implications, as it could increase the aggregation propensity of αS. The binding of copper ions to αS promotes its aggregation. This suggested the involvement of copper ions in the development of PD. Nevertheless, their effect on the αS/membrane affinity and on the conformation of the membrane-bound αS has not been yet studied. The amyloid aggregates of αS found in Lewy bodies usually contain post-translational modifications (PTMs). These include Met oxidation, Tyr nitration, and non-enzymatic glycosylation (glycation). αS contains four Met and four Tyr susceptible to undergo oxidation and nitration, respectively, when they are under the oxidative conditions found in PD brains. Glycation is a random process that occurs on Lys side chains as a result of their reaction with reactive carbonyl species arising as side products of the intraneuronal glycolysis. Many studies have tried to elucidate the molecular mechanism correlating these PTMs with the aggregation of αS and the development of PD. However, it is still unclear how they affect the physiological function of αS, which is tightly related to its interaction with lipid membranes. Its knowledge is key to fully understand how these PTMs could contribute to the development of PD. In this thesis, a broad range of biophysical techniques was used to better understand the effect of copper binding and some PTMs (i.e., oxidation, nitration, and glycation) on the conformation of the membrane-bound αS and on its ability to bind lipid membranes. To do that, homogeneously oxidized (αS-MetO), nitrated (αS-NO2) and glycated (αS-CEL) αS were previously synthetized. The work presented here proves that the binding of Cu2+ or Cu+ does not affect the α-helical conformation of the micelle-bound αS, nor the αS-micelle binding. Likewise, the three studied PTMs do not dramatically alter the α-helical conformation displayed by the membrane-bound αS. However, they diminish the affinity of αS towards synaptic-like membranes and hamper its ability to promote the clustering and fusion of synaptic vesicles.