Predicting Pseudomonas aeruginosa susceptibility phenotypes from whole genome sequence resistome analysis

Abstract

[eng] The growing prevalence of nosocomial infections produced by MDR and particularly XDR Pseudomonas aeruginosa strains is associated with significantly increased morbidity and mortality, since it compromises the selection of effective therapies. This increasing threat results from the extraordinary capacity of P. aeruginosa for developing resistance to nearly all available antibiotics by the selection of mutations in chromosomal genes and from the growing prevalence of transferable resistance determinants, particularly those encoding carbapenemases or extended spectrum β-lactamases, frequently co-transferred with aminoglycoside-modifying enzymes determinants and linked to epidemic high-risk clones such as ST111, ST175 and ST235 disseminated in hospitals worldwide. The combined analysis of chromosomal resistance genes and resistance determinants allow establishing the antibiotic resistance genotype which should correlate with the antibiotic resistance phenotype. Even though several initiatives have provided useful clues and tools for the prediction of the resistance phenotype from WGS genotype analysis over recent years, our current capacity to fully predict the phenotype from the genotype is still incomplete and needs to be continuously refined upon the introduction of novel agents and/or the emergence of novel resistance mechanisms or mutations. In this doctoral thesis, a genotypic score was developed to predict P.aeruginosa SIR phenotypes for five relevant antipseudomonal agents: ceftazidime, ceftolozane/tazobactam, meropenem, ciprofloxacin and tobramycin based on WGS-data. A set of 40 chromosomal resistance genes potentially involved in mutation-driven resistance were selected to develop the genotypic score system for these five antipseudomonal agents. The presence of acquired resistance determinants and mutations within the chromosomal genes was then scored for each antipseudomonal agent, ranging their effect onto antibiotic resistance from 0 (no effect) to 1 (EUCAST clinical resistance). One hundred wild-type strains obtained from 51 different Spanish hospitals during a 2017 multicenter study were fully sequenced and analyzed in order to define a catalogue of natural polymorphisms in these 40 chromosomal resistance genes. A total of 455 different missense mutations were classified as P. aeruginosa natural polymorphisms. These mutations without a directly effect in antimicrobial resistance were removed from the resistome analysis. The capacity of genotypic score to predict the susceptibility phenotype was tested in 204 clinical isolates from a Spanish collection and 105 clinical respiratory isolates from a European-ICUs collection. Although a margin for improvement was evidenced in this proof of concept study, an overall good correlation between the genotypic resistance score and the susceptibility profile was documented in both cohorts. The developed score system was able to predict ceftolozane/tazobactam susceptible and resistance in 100% of cases. Furthermore, the capacity to predict susceptibility to ceftazidime (97.7-100%), tobramycin (100-100%) and ciprofloxacin (95.5-100%) was very high in both cohorts. In contrast, the prediction of clinical resistance was far more variable depending on the agent. The prediction of resistance to meropenem was particularly low (46.1-93.9%), whereas the capacity to predict clinical resistance to ceftazidime (72.4-95.7%), tobramycin (87.1-100%) and ciprofloxacin (94.1-98.3%) was highest, especially in the international cohort. Further refining of the scoring system improved including novel resistance targets and extending both the catalogue of the natural polymorphisms and the panel of resistance genes and the development of a web-based bioinformatics tool for the automatic determination of the genotypic scores should follow.

[cat] La creixent prevalença d’infeccions nosocomials produïdes per soques de Pseudomonas aeruginosa multirresistents (MDR) i, particularment, extremadament resistents (XDR) s’associa amb un augment significatiu de la morbiditat i mortalitat, ja que compromet la selecció de teràpies efectives. Aquesta amenaça creixent resulta de l’extraordinària capacitat de P. aeruginosa per desenvolupar resistència a quasi tots els antibiòtics disponibles mitjançant la selecció de mutacions en gens cromosòmics, i de l’augment en la prevalença de determinants de resistència transferibles, particularment aquells que codifiquen carbapenemases o β-lactamases d’espectre estès (BLEE), freqüentment co-transferits amb determinants d’enzims modificants d’aminoglicòsids i lligats a clons epidèmics d’alt risc, com ST111, ST175 i ST235, disseminats a hospitals de tot el món. L’anàlisi dels gens de resistència cromosòmics juntament amb els determinants de resistència permet establir el genotip de resistència a antibiòtics, que hauria de correlacionar amb el fenotip de resistència. Malgrat que diverses iniciatives han proporcionat pistes i eines útils per a la predicció del fenotip de resistència a partir de l’anàlisi del genotip mitjançant la seqüenciació del genoma complet (WGS) en els últims anys, la nostra capacitat actual per predir completament el fenotip a partir del genotip segueix essent incompleta i necessita ser refinada contínuament davant la introducció de nous agents i/o l'aparició de nous mecanismes o mutacions de resistència. En aquesta tesis doctoral, es va desenvolupar un sistema de puntuació genotípic per predir els fenotips SIR de P. aeruginosa davant de cinc agents antipseudomònics rellevants: ceftazidima, ceftolozà/tazobactam, meropenem, ciprofloxacina i tobramicina, basant-se en dades de seqüenciació del genoma complet (WGS). Es va seleccionar un conjunt de 40 gens cromosòmics de resistència, potencialment implicats en la resistència mediada per mutacions, per desenvolupar el sistema de puntuació genotípic per a aquests cinc antibiòtics. La presència de determinants de resistència adquirits i mutacions dins dels gens cromosòmics es va puntuar per a cada agent antipseudomònic, qualificant el seu efecte sobre la resistència antibiòtica de 0 (sense efecte) a 1 (resistència clínica segons EUCAST). Es van seqüenciar i analitzar completament 100 soques silvestres obtingudes de 51 hospitals espanyols diferents durant un estudi multicèntric al 2017, amb la finalitat de definir un catàleg de polimorfismes naturals en aquests 40 gens cromosòmics de resistència. Un total de 455 mutacions van ser classificades com a polimorfismes naturals de P. aeruginosa. Aquestes mutacions sense un efecte directe en la resistència antimicrobiana es van eliminar de l’anàlisi del resistoma. La capacitat del sistema de puntuació genotípica per predir el fenotip de susceptibilitat es va provar en 204 aïllats clínics d'una col·lecció espanyola i en 105 aïllats respiratoris clínics d'una col·lecció europea d'UCIs. Malgrat que es va evidenciar un marge de millora en aquest estudi de prova de concepte, es va documentar una bona correlació global entre la puntuació de resistència genotípica i el perfil de susceptibilitat en ambdues cohorts. El sistema de puntuació desenvolupat va ser capaç de predir la susceptibilitat i la resistència a ceftolozà/tazobactam en el 100% dels casos. A més, la capacitat per predir la susceptibilitat a ceftazidima (97,7-100%), tobramicina (100-100%) i ciprofloxacina (95,5-100%) va ser molt alta en ambdues cohorts. No obstant això, la predicció de la resistència clínica va ser molt més variable segons l'agent. La predicció de resistència a meropenem va ser particularment baixa (46,1-93,9%), mentre que la capacitat per predir la resistència clínica a ceftazidima (72,4-95,7%), tobramicina (87,1-100%) i ciprofloxacina (94,1-98,3%) va ser més alta, especialment en la cohort internacional. En un futur s'haurà de millorar el sistema de puntuació incloent nous objectius de resistència i ampliant tant el catàleg de polimorfismes naturals com el panell de gens de resistència. A més del desenvolupament d'una eina bioinformàtica per a la determinació automàtica de les puntuacions genotípiques.

[spa] La creciente prevalencia de infecciones nosocomiales producidas por cepas de Pseudomonas aeruginosa multirresistentes (MDR) y, particularmente, extremadamente resistentes (XDR) se asocia con un aumento significativo de la morbilidad y mortalidad, ya que compromete la selección de terapias efectivas. Esta amenaza creciente resulta de la extraordinaria capacidad de P. aeruginosa para desarrollar resistencia a casi todos los antibióticos disponibles mediante la selección de mutaciones en genes cromosómicos, y del aumento en la prevalencia de determinantes de resistencia transferibles, particularmente aquellos que codifican carbapenemasas o β-lactamasas de espectro extendido (BLEE), frecuentemente co-transferidos con determinantes de enzimas modificantes de aminoglucósidos y vinculados a clones epidémicos de alto riesgo, como ST111, ST175 y ST235, diseminados en hospitales de todo el mundo. El análisis de los genes de resistencia cromosómicos junto con los determinantes de resistencia permite establecer el genotipo de resistencia a antibióticos, que debería correlacionar con el fenotipo de resistencia a los mismos. A pesar de que varias iniciativas han proporcionado pistas y herramientas útiles para la predicción del fenotipo de resistencia a partir del análisis del genotipo mediante secuenciación del genoma completo (WGS) en los últimos años, nuestra capacidad actual para predecir completamente el fenotipo a partir del genotipo sigue siendo incompleta y necesita ser refinada continuamente ante la introducción de nuevos agentes y/o la aparición de nuevos mecanismos o mutaciones de resistencia. En esta tesis doctoral, se desarrolló un sistema de puntuación genotípico para predecir los fenotipos SIR de P. aeruginosa frente a cinco agentes antipseudomónicos relevantes: ceftazidima, ceftolozano/tazobactam, meropenem, ciprofloxacino y tobramicina, basándose en datos de secuenciación del genoma completo (WGS). Se seleccionó un conjunto de 40 genes cromosómicos de resistencia, potencialmente implicados en la resistencia mediada por mutaciones, para desarrollar el sistema de puntuación genotípico para estos cinco antibióticos. La presencia de determinantes de resistencia adquiridos y mutaciones dentro de los genes cromosómicos se puntuó para cada agente antipseudomónico, calificando su efecto sobre la resistencia antibiótica de 0 (sin efecto) a 1 (resistencia clínica según EUCAST). Se secuenciaron y analizaron completamente 100 cepas silvestres obtenidas de 51 hospitales españoles diferentes durante un estudio multicéntrico en 2017, con el fin de definir un catálogo de polimorfismos naturales en estos 40 genes cromosómicos de resistencia. Un total de 455 mutaciones fueron clasificadas como polimorfismos naturales de P. aeruginosa. Estas mutaciones sin un efecto directo en la resistencia antimicrobiana se eliminaron del análisis del resistoma. La capacidad del sistema de puntuación genotípica para predecir el fenotipo de susceptibilidad se testó en 204 aislados clínicos de una colección española y en 105 aislados respiratorios clínicos de una colección europea de UCIs. Aunque se evidenció un margen de mejora en este estudio de prueba de concepto, se documentó una buena correlación global entre la puntuación de resistencia genotípica y el perfil de susceptibilidad en ambas cohortes. El sistema de puntuación desarrollado fue capaz de predecir la susceptibilidad y la resistencia a ceftolozano/tazobactam en el 100% de los casos. Además, la capacidad para predecir la susceptibilidad a ceftazidima (97,7-100%), tobramicina (100-100%) y ciprofloxacino (95,5-100%) fue muy alta en ambas cohortes. Sin embargo, la predicción de la resistencia clínica fue mucho más variable según el agente. La predicción de resistencia a meropenem fue particularmente baja (46,1-93,9%), mientras que la capacidad para predecir la resistencia clínica a ceftazidima (72,4-95,7%), tobramicina (87,1-100%) y ciprofloxacino (94,1-98,3%) fue mayor, especialmente en la cohorte internacional. En un futuro se deberá mejorar el sistema de puntuación incluyendo nuevos objetivos de resistencia y ampliando tanto del catálogo de polimorfismos naturales como el panel de genes de resistencia. Además del desarrollo de una herramienta bioinformática para la determinación automática de las puntuaciones genotípicas.