Nuevos vínculos entre metabolismo del peptidoglicano, producción de β–lactamasas, eficacia biológica y virulencia en Gram-negativos ESKAPE

Abstract

[spa] Introducción: El uso de antibióticos es, actualmente, esencial para la salud humana. Aun así, la progresiva aparición de bacterias resistentes y el limitado desarrollo de nuevos compuestos desemboca en infecciones cada vez más difíciles de tratar. Esta situación impulsa el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, para lo cual es esencial un conocimiento profundo del funcionamiento del patógeno y sus puntos débiles. En consecuencia, el objetivo general de esta tesis fue aportar nuevos datos en el contexto de la relación entre producción de β-lactamasas, metabolismo de la pared celular y virulencia en tres patógenos ESKAPE de especial relevancia (Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae y Klebsiella pneumoniae). En trabajos previos realizados en P. aeruginosa, se demostró que la combinación simultánea de (i) alteración del reciclaje del peptidoglicano y (ii) hiperproducción de la β-lactamasa intrínseca AmpC, causaba una drástica disminución de la virulencia.

Contenido de la investigación: Por tanto, en esta tesis quisimos comprobar si, al sustituir AmpC por otras β-lactamasas horizontales, se reproducía el citado coste biológico. Con este objetivo, analizamos el efecto de distintas enzimas pertenecientes a las clases A, B, C (incluyendo enzimas que aportan resistencia a nuevas combinaciones de β-lactámico/inhibidor de β-lactamasas [BLBLIs]) y D de Ambler, combinadas o no con alteraciones en el reciclaje del peptidoglicano, hallando costes biológicos nulos o muy bajos para β-lactamasas de gran diseminación como la GES-1, la VIM-1 y la OXA-2. En cambio, se registraron costes muy exagerados para variantes de OXA-2 de espectro extendido, para las que describimos que, a mayor capacidad de hidrólisis de ceftazidima y resistencia a nuevos BLBLIs, mayor atenuación de virulencia. Pretendimos también aportar nuevos datos en relación a las bases responsables del coste biológico asociado a la mencionada producción de AmpC en P. aeruginosa. Así, tras inactivar su centro activo, demostramos que además de potenciales alteraciones de la pared celular y sobrecostes energéticos, la actividad enzimática de AmpC en P. aeruginosa es esencial para provocar la atenuación ligada a su hiperproducción, al afectar diferentes características relacionadas con la patogénesis (velocidad de crecimiento, citotoxicidad y motilidad). Nuestros resultados indican, además, que la cefalosporinasa cromosómica de E. cloacae (controlada por AmpR, como AmpC en P. aeruginosa), presenta particularidades que la diferencian de esta última: ausencia de desrepresión escalonada asociada a la inactivación de amidasas tipo AmpD, y ausencia de costes biológicos relevantes ligados al bloqueo del reciclaje del peptidoglicano y/o hiperproducción de la β-lactamasa. Además, demostramos que la segunda cefalosporinasa cromosómica putativa presente en E. cloacae no contribuye a la resistencia de esta especie. Finalmente, pretendimos determinar si estos hallazgos en P. aeruginosa y E. cloacae podían ser aplicables a K. pneumoniae portadora de β-lactamasas plasmídicas de clase C (CMY-2 y DHA-1), describiendo costes biológicos poco relevantes, incluso en caso de bloqueo del reciclaje del peptidoglicano. Sin embargo, el hallazgo más importante fue la demostración de la posibilidad de hiperproducción de la DHA-1, que causó incrementos significativos en el perfil de resistencia (incluyendo ceftolozano/tazobactam), tanto en mutantes hiperproductores generados in vitro como en cepas clínicas. Este fenómeno pone de manifiesto que no sólo debería considerarse la presencia/ausencia de estos determinantes en la rutina clínica, sino también su nivel de producción, ante el riesgo de implicar resistencias desconocidas y la posibilidad de diseminación horizontal.

Conclusión: En definitiva, la interrelación entre metabolismo del peptidoglicano, producción de β-lactamasas y virulencia es un tema altamente complejo, que ha demostrado grandes variaciones en función de la enzima y la especie bacteriana. Aun así, esta tesis supone un claro avance en el conocimiento dentro de este campo, acercándonos a estrategias que permitirían utilizar la propia resistencia antibiótica de los patógenos ESKAPE como arma de doble filo para disminuir su patogénesis.

[eng] Introduction: Antibiotics are currently essential for human health. Nevertheless, the progressive emergence of resistant bacteria and the limited development of new compounds have led to infections that are increasingly difficult to treat. This situation drives the development of new therapeutic strategies, for which a deep understanding of the pathogen's metabolism and their weak points is essential. Consequently, the overall goal of this thesis was to provide new data in the context of the relationship between β-lactamase production, cell wall metabolism and virulence in three particularly relevant ESKAPE pathogens (Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, and Klebsiella pneumoniae). Previous work on P. aeruginosa demonstrated that the simultaneous combination of (i) alteration of peptidoglycan recycling and (ii) hyperproduction of the intrinsic β-lactamase AmpC resulted in a drastic decrease in virulence.

Research content: Therefore, in this thesis, we aimed to test whether replacing AmpC with other horizontal β-lactamases would reproduce this biological cost. To this end, we analyzed the effect of various enzymes from classes A, B, C (including enzymes that confer resistance to new combinations of β-lactam/inhibitor of β-lactamases [BLBLIs]), and D of Ambler, combined or not with alterations in peptidoglycan recycling, finding negligible or very low biological costs for widely disseminated β-lactamases such as GES-1, VIM-1, and OXA-2. In contrast, very exaggerated costs were recorded for extended-spectrum variants of OXA-2, where we observed that, as the capacity to hydrolyze ceftazidime and resistance to new BLBLIs increased, there was greater attenuation of virulence. We also aimed to provide new data on the bases responsible for the biological cost associated with the production of AmpC in P. aeruginosa. Thus, after inactivating its active site, we demonstrated that, in addition to potential alterations in the cell wall and energy overcosts, the enzymatic activity of AmpC in P. aeruginosa is essential to induce the attenuation linked to its hyperproduction, as it affects various characteristics related to pathogenesis (growth rate, cytotoxicity, and motility). Our results also indicate that the chromosomal cephalosporinase of E. cloacae (controlled by AmpR, as AmpC in P. aeruginosa) has particularities that differentiate it from the latter: the absence of gradual derepression associated with the inactivation of AmpD-type amidases, and the absence of significant biological costs linked to the blockage of peptidoglycan recycling and/or hyperproduction of the β-lactamase. Moreover, we demonstrated that the second putative chromosomal cephalosporinase present in E. cloacae does not contribute to the resistance of this species. Finally, we aimed to determine whether these findings in P. aeruginosa and E. cloacae could be applicable to K. pneumoniae carrying plasmid-borne class C β-lactamases (CMY-2 and DHA-1), describing minimal biological costs even in the case of peptidoglycan recycling blockade. However, the most important finding was the demonstration of the possibility of hyperproduction of DHA-1, which caused significant increases in the resistance profile (including ceftolozane/tazobactam), both in in vitro generated hyperproducer mutants and in clinical strains. This phenomenon highlights that not only should the presence/absence of these determinants be considered in routine clinical practice, but also their production levels, given the risk of involving unknown resistances and the possibility of horizontal spread.

Conclusion: In conclusion, the interplay between peptidoglycan metabolism, β-lactamase production, and virulence is a highly complex issue that has shown large variations depending on the enzyme and bacterial species. Nevertheless, this thesis represents a clear advancement in knowledge within this field, bringing us closer to strategies that could use the antibiotic resistance of ESKAPE pathogens as a double-edged sword to reduce their pathogenesis.

[cat] Introducció: L'ús d'antibiòtics és, actualment, essencial per a la salut humana. Tot i això, l'aparició progressiva de bacteris resistents i el desenvolupament limitat de nous composts ha conduït a infeccions cada cop més difícils de tractar. Aquesta situació impulsa el desenvolupament de noves estratègies terapèutiques, per a les quals és essencial un coneixement profund del funcionament del patogen i els seus punts febles. En conseqüència, l'objectiu general d'aquesta tesi fou aportar noves dades en el context de la relació entre producció de β-lactamases, metabolisme de la paret cel•lular i virulència en tres patògens ESKAPE de particular rellevància (Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae i Klebsiella pneumoniae). En treballs anteriors realitzats a P. aeruginosa es va demostrar que la combinació simultània de: (i) alteració del reciclatge del peptidoglicà i (ii) hiperproducció de la β-lactamasa intrínseca AmpC, causava una disminució dràstica de la virulència.

Contingut de la investigació: Per tant, en aquesta tesi vam voler comprovar si, substituint AmpC per altres β-lactamases horitzontals, es reproduïa el cost biològic esmentat. Així, vam analitzar l'efecte de diversos enzims de les classes A, B, C (incloent enzims que aporten resistència a noves combinacions de β-lactàmic/inhibidor de β-lactamases [BLBLIs]) i D d'Ambler, combinades o no amb alteracions al reciclatge del peptidoglicà, trobant costs biològics nuls o molt baixos per a β-lactamases de gran disseminació com la GES-1, la VIM-1 i la OXA-2. En canvi, es van registrar costs molt exagerats per a variants d’OXA-2 d'espectre ampliat, per a les quals vam descriure que, a mesura que augmentava la capacitat d'hidròlisi de la ceftazidima i la resistència a nous BLBLIs, disminuïa la virulència. Vam voler aportar també noves dades relacionades amb les bases responsables del cost biològic associat a la producció d’AmpC a P. aeruginosa. En conseqüència, després d'inactivar el seu centre actiu, vam demostrar que, a més d'alteracions potencials de la paret cel•lular i sobrecosts energètics, l'activitat enzimàtica d'AmpC era essencial per a provocar l'atenuació lligada a la seva hiperproducció, ja que afecta diferents característiques relacionades amb la patogènesi (velocitat de creixement, citotoxicitat i mobilitat). Els nostres resultats indiquen, a més, que la cefalosporinasa cromosòmica d' E. cloacae (controlada per AmpR, com l’AmpC de P. aeruginosa) presenta particularitats que la diferencien d'aquesta darrera: absència de desrepressió escalonada associada a la inactivació d'amidases de tipus AmpD, i absència de costs biològics rellevants lligats al bloqueig del reciclatge del peptidoglicà i/o hiperproducció de la β-lactamasa. A més, vam demostrar que la segona cefalosporinasa cromosòmica putativa present a E. cloacae no contribueix a la resistència d'aquesta espècie. Finalment, vam voler determinar si aquests descobriments a P. aeruginosa i E. cloacae podrien ser aplicables a K. pneumoniae portadora de β-lactamases plasmídiques de classe C (CMY-2 i DHA-1), descrivint costs biològics poc rellevants fins i tot en cas de bloqueig del reciclatge del peptidoglicà. Tanmateix, el descobriment més important fou la demostració de la possibilitat d’hiperproducció de DHA-1, que generà increments significatius al perfil de resistència (incloent ceftolozano/tazobactam), tant a mutants hiperproductors generats in vitro com a soques clíniques. Aquest fenomen posa de manifest que no només s'hauria de considerar la presència/absència d'aquests determinants a la rutina clínica, sinó també el nivell de producció, davant el risc d'implicar resistències desconegudes i la possibilitat de disseminació horitzontal.

Conclusió: En definitiva, la interrelació entre el metabolisme del peptidoglicà, producció de β-lactamases i virulència és un tema altament complex, que ha demostrat grans variacions en funció de l'enzim i l'espècie bacteriana. Tot i així, aquesta tesi suposa un clar avanç en el coneixement dins aquest camp, apropant-nos a estratègies que permetrien emprar la pròpia resistència antibiòtica dels patògens ESKAPE com a arma de doble tall per a disminuir la seva patogènesi.