Translational impact of the study of the immune lipidome in patients with colon cancer: from blood to tumor infiltrates

Abstract

[eng] Colon cancer is a leading cause of cancer-related mortality worldwide, with the tumor microenvironment (TME) significantly contributing to immune evasion and resistance to immunotherapy. Within the TME, lipids play critical roles in modulating immune cell functionality and tumor-immune interactions, presenting an opportunity to improve our understanding of these processes. Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) is a powerful tool for spatially resolving lipid profiles in tumor sections, offering the potential to study the immune compartment within the TME at unprecedented resolution. The global aim of this study was to assess the translational impact of the lipidome of immune cells on colon cancer diagnosis and prognosis. In addition, the study sought to determine whether lipid profiles obtained under different contexts could be used to provide a comprehensive characterization of the TME of colon tumor sections imaging lipids via MALDI-IMS. However, the establishment of the lipid profiles of immune cells turned out very challenging, as the sample size was scarce. Consequently, it was first necessary to develop methodological advancements for analyzing sorted immune cells by utilizing MALDI-MS as a key analytical tool. The drop-overlay method improved sample confluence and sensitivity for MALDI-MS analysis, enabling reproducible lipid profiling of 104 immune cells. This methodological advancement allowed a comprehensive lipid profiling and facilitated the study of immune cells in both circulation and tumor contexts. After optimizing the protocol, we isolated immune cell populations from the peripheral blood of healthy donors to analyze their lipid profiles. Our goal was to determine whether distinct lipid compositions could reliably identify specific immune cell types. The lipid profiling revealed striking specificity in lipid composition among different immune cell types, reflecting their diverse functional roles. Next, we examined how immune cell activation affects lipid composition through a series of ex vivo experiments, aiming to determine whether cell-specific lipid profiles reflect functional adaptations to stimulation. Ex vivo activation experiments demonstrated significant lipid remodeling in T cells and macrophages, characterized by a consistent depletion in the relative content of arachidonic acid (AA)-containing phosphatidylethanolamine (AA-PE) and phosphatidylcholine (AA-PC) species, while the levels of monounsaturated fatty acid-containing (MUFA-containing) species increased. These changes were supported by upregulated expression of lipid-metabolizing enzymes, confirming that immune activation triggers a remodeling process consistent with the lipid changes upon activation to meet functional demands. To extend these findings to a clinical context, we analyzed the lipid profiles of peripheral blood immune cells from patients with colon cancer, focusing on the same cell types studied in healthy individuals. In these patients, circulating immune cells exhibited lipidomic changes similar to those observed during ex vivo activation, consistent with a tumor-driven systemic process of immune cell activation. Finally, we isolated tumor-infiltrating lymphocytes (T cells and B cells), tumor-associated neutrophils (TAN), and tumor-associated macrophages (TAM, specifically M1- and M2-like phenotypes) using FACS and establish their lipid profiles to evaluate whether these profiles could aid in identifying immune cell signatures in colon tumor sections imaged by MALDI-IMS. Tumor-infiltrating immune cells showed enhanced lipid remodeling compared to the circulating counterparts, with changes closely mirroring ex vivo activation findings. These results revealed how immune cells adapt metabolically within the TME, reflecting the combined influence of systemic and local environmental factors. Validation of immune cell lipid profiles using MALDI-IMS demonstrated strong alignment between the lipid profiles of isolated immune cells and segmentation clusters in tumor sections. Thus, the lipid profiles of tumor-infiltrating T cells matched those of clusters within regions of acute lymphocytic infiltration, confirming the fidelity of MALDI-IMS in capturing in situ immune-tumor composition. This consistency highlights the utility of MALDI-IMS for studying spatially resolved lipidomics and elucidating immune cell metabolic state within the TME. In conclusion, this work establishes the lipidome as a defining feature of immune cell identity and functionality, with lipid composition shaping cell-specific roles in health and disease. MALDI-IMS lipidomic analysis offers a powerful framework for studying the immune compartment within the TME, advancing our understanding of tumor-immune interactions, and guiding the development of precision immunotherapeutic strategies for colon cancer.

[spa] El cáncer de colon es una de las principales causas de mortalidad por cáncer en todo el mundo. Uno de los factores determinantes de esta enfermedad es el microambiente tumoral, que desempeña un papel crucial en la evasión del sistema inmune y la resistencia a la inmunoterapia. Dentro de este microambiente, los lípidos son fundamentales para modular la funcionalidad de las células inmunitarias y las interacciones entre el tumor y el sistema inmune, ofreciendo una valiosa oportunidad para profundizar en la comprensión de estos procesos. La espectrometría de masas mediante desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-IMS) es una herramienta poderosa que permite analizar perfiles lipídicos con resolución espacial en secciones tumorales preservando su contexto anatómico. Esto posibilita el estudio del compartimento inmunitario dentro del microambiente tumoral con una precisión sin precedentes. El objetivo principal de este estudio era evaluar el impacto del lipidoma de las células inmunitarias en el diagnóstico y pronóstico del cáncer de colon. Además, se buscaba determinar si los perfiles lipídicos obtenidos en diferentes contextos podían proporcionar una caracterización detallada del microambiente tumoral mediante la distribución espacial de lípidos analizada por MALDI-IMS. Sin embargo, establecer los perfiles lipídicos de las células inmunitarias presentó grandes desafíos debido al tamaño reducido de las muestras. Fue necesario desarrollar avances metodológicos para analizar estas células de manera aislada utilizando MALDI-MS, una técnica diseñada originalmente para medir secciones histológicas. El desarrollo del método de superposición de gotas mejoró la concentración de las muestras y la sensibilidad del análisis, permitiendo la obtención de perfiles lipídicos de 104 células inmunitarias aisladas. Este avance metodológico no solo permitió establecer perfiles lipídicos reproducibles, sino que también facilitó el análisis de células inmunitarias en contextos de circulación y de infiltración en tumores de colon. Una vez optimizado el protocolo, se aislaron poblaciones de células inmunitarias de sangre periférica de donantes sanos para analizar sus perfiles lipídicos. El objetivo era determinar si las distintas composiciones lipídicas podían diferenciar de forma fiable tipos específicos de células inmunitarias. Los análisis revelaron una sorprendente especificidad en la composición lipídica de los diferentes tipos de células inmunitarias, reflejando su diversidad funcional. Posteriormente, se investigó cómo la activación de estas células afecta su composición lipídica mediante experimentos ex vivo diseñados para evaluar si los perfiles lipídicos específicos reflejan adaptaciones funcionales a la estimulación. Los experimentos de activación ex vivo demostraron una remodelación lipídica significativa en células T y macrófagos. Esta remodelación se caracterizó por una disminución relativa de especies lipídicas que contienen ácido araquidónico (AA), como fosfatidiletanolamina (AA-PE) y fosfatidilcolina (AA-PC), y un aumento de especies con ácidos grasos monoinsaturados (MUFA). Estos cambios se correlacionaron con una mayor expresión de enzimas implicados en el metabolismo lipídico, confirmando que la activación inmunitaria induce una remodelación funcional para satisfacer las demandas metabólicas del estado activado. Para trasladar estos hallazgos al contexto clínico, se analizaron los perfiles lipídicos de células inmunitarias de sangre periférica de pacientes con cáncer de colon, centrándose en los mismos tipos celulares estudiados en individuos sanos. En los pacientes, las células inmunitarias circulantes mostraron cambios lipídicos similares a los observados durante la activación ex vivo, lo que sugiere un proceso sistémico de activación inmunitaria impulsado por el tumor. Adicionalmente, se aislaron linfocitos infiltrantes de tumores (células T y B), neutrófilos asociados a tumores (TAN) y macrófagos asociados a tumores (TAM, incluyendo fenotipos M1 y M2) mediante FACS, y se establecieron sus perfiles lipídicos. El objetivo era evaluar si estos perfiles podían identificar de forma fiable los distintos tipos de células inmunitarias en secciones tumorales analizadas por MALDI-IMS. Las células inmunitarias infiltradas en los tumores mostraron una remodelación lipídica más pronunciada que sus contrapartes circulantes, reflejando adaptaciones metabólicas al microambiente tumoral. Estos hallazgos evidencian la influencia combinada de factores ambientales locales y sistémicos en estas células. La validación de los perfiles lipídicos mediante MALDI-IMS mostró una fuerte correlación entre los perfiles obtenidos de células inmunitarias aisladas y los grupos de segmentación generados en secciones tumorales basados en la similitud de la composición lipídica. Por ejemplo, los perfiles lipídicos de células T infiltrantes de tumores coincidieron con los grupos identificados en regiones de infiltración linfocítica aguda, confirmando la idoneidad de MALDI-IMS para estudiar in situ las interacciones entre el tumor y el sistema inmune circundante. En conclusión, este trabajo demuestra que el lipidoma es una característica distintiva de la identidad y funcionalidad de las células inmunitarias, y que la composición lipídica determina sus funciones específicas en condiciones fisiológicas y patológicas. El análisis lipidómico mediante MALDI-IMS se presenta como una herramienta poderosa para estudiar el compartimento inmunitario dentro del microambiente tumoral y constituye una estrategia prometedora para guiar el desarrollo de inmunoterapias de precisión para el cáncer de colon.

[cat] El càncer de còlon és una de les principals causes de mortalitat per càncer a nivell mundial. Un factor clau en aquesta malaltia és el microambient tumoral, que contribueix significativament a l’evasió immune i a la resistència a la immunoteràpia. Dins del microambient tumoral, els lípids juguen un paper fonamental modulant la funcionalitat de les cèl·lules immunitàries i les interaccions entre el tumor i el sistema immune, oferint una oportunitat per aprofundir en la comprensió d’aquests processos. La imatge per espectrometria de masses mitjançant desorció/ionització làser assistida per matriu (MALDI-IMS) és una eina potent que permet analitzar els perfils lipídics en seccions tumorals tot preservant el context espacial. Això possibilita l’estudi del compartiment immunitari dins del microambient tumoral amb una resolució sense precedents. L'objectiu d’aquest estudi era avaluar l’impacte translacional del lipidoma de les cèl·lules immunitàries en el diagnòstic i pronòstic del càncer de còlon. A més, es pretenia determinar si els perfils lipídics obtinguts en diversos contextos podrien proporcionar una caracterització detallada del microambient tumoral mitjançant l’anàlisi de la distribució lipídica amb MALDI-IMS. No obstant això, l’establiment de perfils lipídics de les cèl·lules immunitàries va presentar grans desafiaments, especialment a causa de la petita mida de la mostra, ja que el nombre de cèl·lules era molt limitat. Per aquest motiu, va ser necessari desenvolupar avenços metodològics per analitzar cèl·lules immunitàries aïllades utilitzant MALDI-MS, una tècnica principalment dissenyada per a l’anàlisi de seccions histològiques. El desenvolupament del mètode de superposició de gotes va millorar la confluència de la mostra i la sensibilitat de l’anàlisi, permetent establir perfils lipídics de 104 cèl·lules immunitàries aïllades. Aquest avenç metodològic va proporcionar una base per estudiar cèl·lules immunitàries tant en el context circulant com en el de les infiltrades en tumors de còlon. Un cop optimitzat el protocol, es van aïllar poblacions de cèl·lules immunitàries de sang perifèrica de donants sans per analitzar els seus perfils lipídics. L’objectiu era determinar si les composicions lipídiques podien identificar de manera fiable tipus específics de cèl·lules immunitàries. Els perfils lipídics van revelar una sorprenent especificitat composicional entre els diferents tipus de cèl·lules, reflectint la seva diversitat funcional. Es va investigar també com l’activació de les cèl·lules immunitàries afecta la seva composició lipídica mitjançant experiments ex vivo, amb l’objectiu de determinar si aquests perfils reflectien adaptacions funcionals a l’estimulació. Els experiments ex vivo van demostrar una remodelació lipídica significativa en cèl·lules T i macròfags, caracteritzada per una disminució d’espècies amb àcid araquidònic (AA) en les classes lipídiques fosfatidiletanolamina (AA-PE) i fosfatidilcolina (AA-PC), i un augment d’espècies amb àcids grassos monoinsaturats (MUFA). Aquests canvis es correlacionaven amb l’expressió elevada d’enzims implicats en el metabolisme lipídic, evidenciant que l’activació immunitària indueix una remodelació funcional adaptativa. Per ampliar aquestes troballes al context clínic, es van analitzar els perfils lipídics de cèl·lules immunitàries de sang perifèrica de pacients amb càncer de còlon. Els resultats van mostrar canvis lipídics similars als observats durant l’activació ex vivo, suggerint un procés d’activació sistèmic impulsat pel tumor. A més, es van aïllar limfòcits infiltrats als tumors (cèl·lules T i B), neutròfils associats al tumor (TAN) i macròfags associats al tumor (TAM, fenotips M1 i M2) mitjançant FACS per establir els seus perfils lipídics. L’objectiu era determinar si aquests perfils podien identificar de manera fiable cada tipus cel·lular en seccions de tumors de còlon mitjançant MALDI-IMS. Les cèl·lules immunitàries infiltrades en tumors van mostrar una remodelació lipídica més accentuada que les seves homòlogues circulants, reflectint adaptacions metabòliques al microambient tumoral. Els resultats van revelar la influència combinada de factors ambientals locals i sistèmics en aquestes cèl·lules. La validació dels perfils lipídics mitjançant MALDI-IMS va demostrar una forta correlació entre els perfils de cèl·lules immunitàries aïllades i els grups generats en seccions tumorals, basats en la similitud de la composició lipídica. Per exemple, els perfils lipídics de cèl·lules T infiltrades coincidien amb els grups dins de les regions d’infiltració limfocítica aguda, confirmant l’adequació de MALDI-IMS per estudiar les interaccions tumor-sistema immune in situ. En conclusió, aquest treball estableix que el lipidoma és una característica distintiva de la identitat i funcionalitat de les cèl·lules immunitàries, determinant les seves funcions en condicions fisiològiques i patològiques. L’anàlisi lipidòmica mitjançant MALDI-IMS proporciona una eina potent per estudiar el compartiment immunitari dins del microambient tumoral i pot guiar el desenvolupament d’estratègies d’immunoteràpia de precisió per al càncer de còlon.